ELISA的概念操作步驟

(一)　原理

elisa是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

(二)　操作步驟

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為～0μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.ml。37℃孵育0.5～小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.ml，37℃0～30分鐘。

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則40nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.倍，即為陽性。

方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至～0μg/ml，每孔加0.ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。